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光化学衍生法结合HPLC测定食品和饲料中的黄曲霉毒素

[导读]黄曲霉毒素的急性毒性很强, 是重要的致癌物质。本文采用光化学衍生法结合HPLC 测定了食品和饲料中的黄曲霉毒素, 研究了光化学衍生的效果。结果表明, 经光化学柱后衍生, 四种黄曲霉毒素的检测灵敏度都比较高, 检出限可达到3. 25pg。

0􀀁 前言

自然界中的霉菌分布广泛, 种类繁多。据联合国粮农组织估计, 目前世界上至少有25% 左右的谷物被霉菌毒素污染, 其中最为严重的是黄曲霉毒素的污染, 对畜禽造成的危害极大。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物, 它们是一类具有相似结构的二氢呋喃杂氧萘的衍生物。最常见的黄曲霉毒素有B1、B2、G1、G2、M1 等, 其中B1毒性最强, M1、G1 次之, B2、G2 较弱〔1- 3〕。B1 的毒性是氰化钾的10倍, 砒霜的68倍。研究证实, 黄曲霉毒素具有极强的毒性和致癌性, 可引发动物及人类的肝癌、肾癌、胃癌等〔4 - 8〕。1988年, B1 被国际肿瘤研究机构正式确定为一级致癌物。因此, 自从20世纪60年代发现黄曲霉毒素以来, 世界各国对黄曲霉毒素的产生、代谢、毒性、分析方法及去毒方法等进行了大量研究〔9 - 14〕。目前, 研究重点逐渐转移到检测方法的改进。

由于黄曲霉毒素具有毒性大、致癌力强、含量低(通常0 ~ 200 ppb)和结构相似的特点, 这就要求检测方法灵敏度高、特异性强, 集分离与检测为一体。近年来, 因其高效、快速、灵敏度高、重现性好、准确可靠等优点, 用液相色谱法测定食品和饲料中的黄曲霉毒素已得到越来越广泛的应用〔15 - 21〕。然而一直困扰人们的问题是, 荧光检测器对四种黄曲霉毒素分子具有选择性, 即对B2、G2的灵敏度高, 而对B1、G1 的灵敏度很低〔22〕。因此, 通常用两种方法来提高B1 和G1 的荧光性: 一是通过改变流动相或改进检测器来降低物质荧光性的损失, 二是对荧光性弱的物质进行柱前或柱后衍生以增强其荧光性〔23〕。利用光化学柱后衍生法( PHRED)来增强B1 和G1 的荧光性是美国Aura公司研发的一项新技术〔24- 26〕, 已逐步应用于实际生产中。这种方法仪器安装简单, 分析快速简捷, 而且线性关系好, 可重复性高。本文将化学衍生法和HPLC 结合起来测定食品和饲料中的黄曲霉毒素, 结果表明该方法显著增强了G1 和B1 的荧光性, 提高了测定的准确度, 精密度和灵敏度。

1􀀁 材料与方法

1. 1􀀁 原理

光化学反应器( PHRED )包括反应池架、紫外灯、反应线圈等。反应线圈安装在反应池架的底部, 当流动相流经反应线圈时, 受到紫外灯的照射, 荧光性较弱的B1 和G1 被衍生为荧光性较强的B2􀀁和G2􀀁 (图1), 而B2 和G2 不受影响, 从而使四种黄曲霉毒素的检测灵敏度都较高。

先将内径为0. 25mm 长度为15m 的反应线圈(KRC, knitted reacto r co il)固定在磨光的支持底座( PSP, po lished support p late) 的平台上, 然后将装有KRC 的PSP放在不锈钢反应池架的底部, 最后小心的把紫外灯管安装在线圈上面的灯架上。线圈的一端与HPLC色谱柱的末端连接, 另一端与荧光检测器相连。在HPLC上连接光化学反应池的简图如下所


1. 2􀀁 试剂与仪器

AFT储备溶液: 黄曲霉毒素B1、B2、G1 和G2 晶体( S igm a Chem ical Co. , S.t Louis, MO )各1mg分别溶解在100mL苯+ 乙腈( 98 + 2, V /V )溶液中, 浓度为10ng /􀀁L。AFT混合工作溶液: 用氮气吹干仪轻轻将苯+ 乙腈吹干, 按一定比例将各黄曲霉毒素储备溶液用甲醇稀释, 得到黄曲霉毒素混合工作溶液, 浓度为: B1,200ng /mL; B2, 200ng /mL; G1, 200ng /mL; G2, 200ng /mL。HP1100液相色谱仪及化学工作站(美国HP 公司) , 配荧光检测器、自动进样器、恒温柱温箱、真空在线脱气机。

光化学反应器: PHRED, 美国Aura公司免疫亲和柱: 美国V icam公司氮气吹干仪: 北京中检维康公司高速均质器: 美国W aring公司泵流操作架: 北京中检维康公司精密移液器: 芬兰Labsystems公司真空抽滤泵, 溶剂过滤器: 天津Autoscience公司M illi- Q 超纯水机: 美国M illipore公司

1. 3􀀁 高效液相色谱条件

色谱柱: 反相C18流速: 0. 8mL /m in流动相: 甲醇+ 水( 45+ 55)检测器: 荧光检测器􀀁ex= 360nm, 􀀁em = 440nm柱温: 38􀀁 进样量: 20􀀁L

1. 4􀀁 样品制备

1. 4. 1􀀁 提取􀀁 准确称取50g粉碎的待测样品于高速均质器中, 另入5g 氯化钠及100mL 甲醇+ 水溶液( 80+ 20) , 盖上均质器盖子, 高速搅拌1m in, 提取物用槽纹滤纸过滤, 滤液再用玻璃纤维滤纸过滤至澄清, 收集澄清液待用。

1. 4. 2􀀁 净化􀀁 将免疫亲和柱连接于10mL玻璃针筒下, 准确移取10mL上述澄清液, 注入玻璃针筒内, 以1~ 2 滴/S 的流速全部通过免疫亲和柱。再3 和10mL纯水以同样的流速淋洗柱子两次, 弃去全部流出液。

用1. 0mL 甲醇淋洗亲和柱, 洗脱速度为1 ~ 2滴/S, 将全部淋洗液( 1mL)收集于测试管中, 加纯水1. 0mL, 混匀, 待测。

1. 4. 3􀀁 测定􀀁 样液通过0. 45􀀁m 微孔滤膜过滤后供HPLC 分析, 进样量20􀀁L, 根据测得各组分的保留时间和峰面积与标准工作曲线比较定性和定量。

1. 5􀀁 标准曲线

将黄曲霉毒素混合工作溶液稀释成一系列浓度,用等体积的纯水混匀, 按仪器条件测定, 得到标准色谱峰, 并作峰面积含量的标准工作曲线。

2􀀁 结果与讨论

2. 1􀀁 萃取方式的选择

样品提取可以采用甲醇+ 水、乙腈+ 水、氯仿作萃取剂, 本实验采用了甲醇+ 水( 8+ 2)这一最有效、对环境影响最小的提取溶液, 用高速均质器搅拌提取样品中的黄曲霉毒素, 取得了满意的效果。

2. 2􀀁 纯化方法的优化

传统的净化方法为液- 液萃取法, 其操作繁琐,有机试剂用量大, 提取效率低, 净化效果差, 环境污染严重。免疫亲和柱( IAC ) 是近年来广泛应用的一种固相萃取( SPE)分离纯化方法, 它是将特异性的黄曲霉毒素单克隆抗体与载体蛋白偶联并填柱而成。由于抗原抗体有一一对应的特异性吸附关系, 所以IAC只能特效性地、高选择性地吸附黄曲霉毒素, 而让其它杂质通过柱子, 使样品得以纯化, 同时这种吸附又可以被极性有机溶剂洗脱, 进行定量检测〔27- 28〕。因此它将提取、净化、浓缩一次完成, 大大简化了前处理过程, 提高了试样的净化效率及检测灵敏度, 同时减少了有毒、有害试剂的应用。


2. 3􀀁 衍生反应的优化

对样品进行衍生化的目的主要是增强黄曲霉毒素B1 和G1 的荧光性, 提高B1 和G1 的检测灵敏度〔23〕。HPLC测定黄曲霉毒素有两种衍生方法即柱前衍生法和柱后衍生法, 柱前衍生法主要有三氟乙酸法和稀盐酸法, 柱后衍生法主要有电化学衍生溴法和碘法及光化学衍生法〔29 - 31〕。本实验采用光化学衍生法, 这种方法不需要特殊的化学试剂和增加额外的泵, 也不需要电化学衍生池等昂贵装置, 而且灵敏度高, 重现性好〔32- 33〕。

2. 4􀀁 流动相的选择

用反相色谱法分析黄曲霉毒素有多种流动相组合体系, 为了延长柱子的使用寿命, 减少有害试剂的应用, 本实验选择了甲醇+ 水体系。结果发现, 甲醇和水比例对出峰时间影响很大, 比例过大, B1, B2,G1、G2 不能得到较好的分离, 比例过小, 出峰时间延长, 并且出现望峰, 最后确定甲醇+ 水比例为45+55, 在10m in内可以使B1、B2、G1、G2 达到基线分离,保留时间分别为G2: 5. 743, G1: 6. 502, B2: 7. 451, B1:8. 719m in(见图4)。

2. 5􀀁 光化学衍生对黄曲霉毒素测定的影响

2. 5. 1􀀁 黄曲霉毒素标准溶液的荧光性检测黄曲霉毒素混合工作溶液( B1、B2、G1、G2 浓度均为25ng /mL)进样20 /􀀁L, 在未进行光化学衍生的情况下(紫外灯关) , 得到的色谱图如图3 所示。同样的进样量经过光化学衍生后(紫外灯开)得到图4所示的色谱图。在图3 中, G2 和B2 的峰形很明显, G1和B1 却几乎检测不到。而在图4中, G2、G1、B2 和B1均出现了非常明显的吸收峰。这说明经过柱后光化学衍生增强了G1 和B1 的荧光性, 提高了其检测灵敏度。

2. 5. 2􀀁 食品和饲料中黄曲霉毒素的测定

用本方法检测食品和饲料样品中的黄曲霉毒素,也显示了相同的效果。图5(紫外灯关)和图6(紫外灯开)为花生样品中黄曲霉毒素( G2 + G1 + B2 + B1 )测定的色谱图, 图7(紫外灯关)和图8(紫外灯开)为发霉玉米样品中黄曲霉毒素( B1 )测定的色谱图,图9(紫外灯关)和图10(紫外灯开)为饲料样品中黄曲霉毒素( G2 + G1 + B2 )测定的色谱图。这说明经过紫外灯的照射, 荧光性较弱的B1 和G1 提高了荧光性, 而B2 和G2 不受影响, 免疫亲和柱的应用也使得样品中的杂质峰大为减少[ 29, 30] , 从而使四种黄曲霉毒素的检测灵敏度都较高。

本方法在样品添加200ppm 黄曲霉毒素时进行10 次测定, 平均回收率分别为B178. 91% 、B274. 23%、G1 70. 04% 、G2 72. 37%, RSD 分别为4. 11%、4. 78% 、7. 60%、5. 33%; 对四种黄曲霉毒素的最低检出限均达到3. 25pg。



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