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基于液相色谱-质谱技术的高尿酸血症血浆代谢组学研究

[导读]利用代谢组学技术研究高尿酸血症患者与健康人血浆的代谢差异情况,寻找差异代谢标志物,为探讨高尿酸血症病因及与其他代谢性疾病的关系提供参考。

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学后出现的以定性和定量描述生物体内多种代谢物动态变化为目的的新兴组学,是系统生物学的重要组成部分。质谱分析和核磁共振(nuclearmagnetic resonance,NMR)是该领域内2种关键的实验技术,其中液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)联用技术集高效液相色谱高分离性能与质谱的高灵敏度、高特异性的优点于一体,逐渐成为代谢组学研究的主流技术。当前临床和流行病学领域已有大量代谢组学的实际应用,用于探索各种疾病的复杂的分子机制。评价各种代谢途径的大量代谢物(如底物、中间产物以及终端产物)的技术更是广泛用于糖尿病、心血管疾病代谢状态的危险评估中[1-3]。高尿酸血症作为世界范围内一般人群中患病率较高的代谢性疾病在当前并未引起足够重视,其与糖尿病、肾病及代谢综合征等代谢性疾病之间具有错综复杂的相互作用[4],代谢组学研究将为揭示高尿酸血症的发病机制、危险因素及其与相关代谢性疾病的发生、发展提供了一个独特视角。

1 材料与方法

1.1 病例来源 收集单纯高尿酸血症男性患者14例,将其作为高尿酸血症组,年龄20~40岁;无背景疾病,如感染,高血脂,高血压,高血糖及肝、肾疾病等;诊断参照中华医学会风湿病学分会定义标准[5]。收集健康成年男性10例作为对照组。

1.2 主要仪器和试剂 主要仪器包括:ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统(美国)、Xevo G2QTof四极杆飞行时间串联质谱仪(美国);Aquity UPLCTM C18 柱(2.1 mm×100mm,1.7μm)、低温高速离心机(德国Beckman公司)、超声清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司);GR-202AND电子分析天平(日本)、热电超低温冰箱(美国Thermo Scientific FormaULT)、华凌BD-42冰箱。主要试剂:大黄素(批号:30269),购自美国Sigma公司;乙腈、甲醇为色谱纯,购自美国Merck公司;纯水由反渗透超纯水仪(GT-30L,上海飞域实验室设备有限公司)制备。

1.3 采样和血浆分离 受检者早餐前空腹于上肢静脉处采血5mL,血样收集于真空肝素抗凝的采血管内,静置10min后4℃1 000×g冷冻离心10min,取离心后的上清液,于-80℃冷冻储存。

1.4 样品处理 取200μL血浆样品至1.5mL的Eppendorf管中,加20μL内标溶液(含10μg/mL大黄素),再加800μL甲醇-乙腈(1∶1,V/V),涡流混合1 min,震荡均匀,然后14 000×g离心30min后,取10μL上清液进样。

1.5 分析条件 采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography-quatrupole-time-offlight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)技术分析高尿酸血症患者和健康者血浆代谢物图谱。

1.5.1 色谱条件 Aquity UPLCTM C18 柱(2.1 mm×100mm,1.7μm),流速0.6mL/min,柱温35℃,流动相A为0.1% FA-H2O,流动相B为0.1%FA-CAN,进样体积0.2L。梯度洗脱程序见表1。


1.5.2 质谱条件 采用Xevo G2QTof四极杆飞行时间串联质谱仪,离子化模式:电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)(+),毛细管电压3kV,Sampling Cone 30V,Extraction Cone4.0V,源温度120℃,雾化气温度550℃,雾化气流速800L/h,锥孔气流速50L/h。

1.6 统计学处理 采用MarkerLynx XS软件对原始数据进行校正和归一化处理,对处理后的数据应用SIMCA-P+12.0.1(瑞典Umctries公司)统计学软件对样品进行分组并采用正交信号校正和偏最小二乘法判别分析(orthogonal signalcorrection-partial least square discriminate analysis,OSC-PLSDA)分析。分析结果以二维和三维得分图(scores plot)和载荷图(loadings plot)的形式表示,考察健康志愿者组和高尿酸血症患者组的样品差异性及获取差异信息。组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 血浆代谢物谱图OSC-PLS-DA结果 应用SIMCA-P+12.0.1软件对MarkerLynx XS导出数据进行OSC-PLS-DA分析,绘制出得分图(图1、2)、载荷图(图3)和S-plot图(图4)。由图1、2可知,高尿酸血症组与对照组分别具有一定的聚类作用,在二维空间得分图中高尿酸血症组和对照组受检者的血浆代谢谱中各自成长条状集中分布,且两组无交叉重叠,明显分开,提示两组之间血浆中小分子代谢物的组成具有差异,OSCPLSOSCPLS-DA方法可以将两组样本较好地分开。并且二维得分图和三维得分图具有很好的一致性。从图3可知,绝大多数点集中在原点附近,只有少数点远离原点。这些远离原点的点实际上就是将高尿酸血症组与对照组患者的血浆样品完全区分开的关键代谢物,也就是说这些代谢物是在高尿酸血症患病血浆内发生显著变化的关键化合物。红框为高尿酸血症组与对照组之间潜在的差异代谢标志物。由图4可看出S-plot的两端是潜在的差异代谢标志物。

2.2 潜在标记物的发现 在OSC滤噪的PLS-DA 模型中VIP(very important in projection)值大于1的变量被看作可能的潜在标记物,通过S-plot图对它们的可靠性进行验证,将和分类相关性低的变量剔除,剩余的变量再进行t检验,P<0.05的变量视为高尿酸血症患者与健康人区分的潜在标记物。经过多种多变量分析手段的结合,最终共有6种质荷比大小的代谢物被认为是区分高尿酸血症患者与健康人的潜在标记物,见表2。经过搜索HMDB (http://www.Hmdb.ca/)数据库及KEGG (http://www.genome.jp/)数据库,同时参照有关文献,结果发现油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、反油酸、异油酸、Pristanal、三甲基十三烷酸、癸烯酸、8-异构前列腺素、Postin、3-葡萄糖苷酸孕二醇、肠抑素、吡啶等近20种物质是高尿酸血症潜在的生物标志物,主要包括脂肪酸和短肽等,准确的结构确认和含量测定有待于二级质谱扫描和利用标准物质进行进一步的对照和计算。


3 讨  论

与传统组学相比,代谢组学有自身的优点[6]。首先是最接近表型,基因和蛋白表达的变化最终以落脚于代谢过程产生终端效应。因此,代谢组学研究是反映生物体系表型和遗传型之间联系的纽带,对了解生物体病理生理和新陈代谢的本质具有重要的作用。其次,基因和蛋白表达的有效的微小变化会在代谢物上得到放大,从而使检测更容易。另外,因为代谢产物在各个生物体系中都是类似的,可以寻找到针对某种代谢物或者一类代谢物的分析方法,而不用考虑物种的区别[7],因此,代谢组学研究中采用的技术更为通用;而且代谢物的种类要远小于基因和蛋白的数目,便于分析。

目前国内关于利用代谢组学进行高尿酸血症研究的仅见1篇报道,钟麟等[8]等利用氢NMR代谢组学方法分析高尿酸血症患者和健康对照者血浆中饱和脂肪酸、N-乙酰糖蛋白、极低密度脂蛋白等代谢物的变化,结合主成分分析(principalcomponent analysis,PCA)和PLS,分析这些目标代谢物的表达差异。结果发现与健康对照组比较,高尿酸血症组患者的饱和脂肪酸、N-乙酰糖蛋白、极低密度脂蛋白、乳酸、乙醇的水平上升,卵磷脂、谷氨酰胺、葡萄糖的水平下降。从而认为高尿酸血症患者相较于健康对照组受检者存在更多脂类代谢异常、糖酵解加剧、谷氨酰胺水平下降等问题,并指出该类物质可能与高尿酸血症的发病、转归和预后有关。由此也提示高尿酸血症患者血脂、血糖代谢亦出现异常,从分子机制上证明尿酸水平与血脂、血糖等质谱分析组分是有关联的。该研究中同时也发现高尿酸血症患者发生了类似心血管疾病进程中的脂类代谢改变,提示高尿酸血症与心血管疾病的关联。

本研究结果提示脂肪酸代谢异常可能是高尿酸血症发病牵涉的代谢途径之一:棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸等脂肪酸主要参与脂肪酸的合成、脂肪酸在线粒体的伸长、脂肪酸代谢以及不饱和脂肪酸的合成等生化反应过程,这些物质在高尿酸血症患者血浆中的升高提示高尿酸血症患者脂肪酸代谢可能发生紊乱。有研究表明硬脂酸、亚油酸、油酸等可作为冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的代谢产物谱。饱和脂肪酸摄入过多是导致高胰岛素血症的危险因素,尤其是棕榈酸(C16∶0),可促使2型糖尿病的发生。脂肪酸引起血压升高和促进高血压血管病变与血浆游离脂肪酸的组成有关,血浆游离脂肪酸对血管内皮细胞有直接作用,在脂肪酸中,损害血管内皮的脂肪酸有硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、软脂酸(C16∶0)等。最新研究表明,高尿酸血症与冠心病、糖尿病、高血压等有密切的相互作用,这在脂质代谢紊乱中得到集中体现。

本研究还发现高尿酸血症患者Pristanal水平可能升高,Pristanal是植烷酸和降植烷酸之间的中间代谢产物,植烷酸和降植烷酸水平升高与过氧化物酶体失调有关,此时,由于缺乏功能性过氧化物酶体而导致植烷酸降解障碍。植烷酸水平升高常与多种代谢紊乱的发生相关,在多种代谢性疾病发生中发挥重要作用。此外,研究结果提示高尿酸血症患者Postin和肠抑素水平可能下降,Postin是胱蛋白酶抑制剂C的N末端四肽,是促吞噬肽激活剂,而促吞噬肽与免疫系统功能相关。肠抑素是脂肪消化时释放自胰辅酯酶的五肽,主要存在于近端小肠,是选择性食欲抑制剂,尤其是针对脂肪摄入。女性肥胖者血浆肠抑素水平常常升高,饱食之后其分泌减少。Liu等[9]采用高效液相色谱-二极管阵列检测器技术检测和鉴定了痛风患者血清和尿液中的新生物标志物,即血清中的尿酸、肌酐、色氨酸和尿液中的尿酸、肌酐、鸟嘌呤核苷及马尿酸。通过对标志物在痛风不同时期的对比发现,与间歇期痛风比较,急性痛风期患者嘌呤、蛋白质以及葡萄糖代谢异常更为显著,急性期由于鸟苷代谢的原因促使血清尿酸水平升高。研究结果对痛风代谢机制的阐明很有帮助,这对本研究的进一步开展以及确定高尿酸血症患者血浆潜在的生物标志物具有借鉴意义。

总之,本研究应用超高效液相色谱技术,结合高分辨率质谱,达到了区分高尿酸血症患者与健康人血浆小分子代谢物的目的,并发现了部分差异代谢标志物。由于时间的原因,本研究没有进行差异代谢标志物的鉴定。在下一步工作中将对这些目标化合物进行跟踪并获得其二级质谱结构信息,必要时结合标准品对照,对其结构进行鉴定和确认,这将有助于揭示高尿酸血症的发病机制及其代谢特征,为其预测和防治奠定基础。





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